ABSTRACT
O objetivo deste trabalho foi estudar a remoção do crioprotetor, em duas ou três etapas, em embriões bovinos produzidos in vitro após a congelação em vapor de Nirtogênio. Blastocistos expandidos (1329) foram mantidos em co-cultivo (controle) ou criopreservados em 3 protocolos de congelação em vapor de nitrogênio. Os embriões foram equilibrados na solução de 10% de EG por 10 minutos e em 17%, 22% ou 28% de EG por 30 segundos. Após o envase, as palhetas foram mantidas em vapor de nitrogênio por 2 minutos e armazenadas em nitrogênio líquido. Após a descongelação, os crioprotetores foram diluídos em duas etapas, usando 0,3M de sacarose e solução isotônica ou em três etapas usando 0,3M de sacarose + 10% de EG; 0,3M de sacarose e solução isotônica. Os embriões foram co-cultivados com células da granulosa, avaliando as taxas de re-expansão após 24 horas e de eclosão após 24, 48, 72 e 96 horas. Para os grupos congelados no vapor e diluição do crioprotetor em duas etapas, as taxas de eclosão foram de 1,94; 11,88 e 6,06% para EG17, EG 22 e EG 28 respectivamente. Já para os grupos com diluição do crioprotetor em três etapas, as taxas de eclosão foram de 4,67; 9,90 e 10,78% para EG17, EG22 e EG28 respectivamente.
The aim of this study was to evaluate the dilution of cryoprotectant in 2 or steps of bovine in vitro-produced embryos after quick-freezing. A total of 1329 expanded blastocyst were kept in co-culture as control group or cryopreserved by 3 quick-freezing protocols. The embryos were exposed to 10% EG for 10 minutes then to 17%, 22% or 28% for 30 seconds. After loading, the straws were held in nitrogen vapor for 2 minutes and then plunged and stored in liquid nitrogen. After warming, cryoprotectants were diluted in two steps using 0.3 M sucrose and isotonic solution, or three steps using 0.3 M sucrose + 10% EG then 0.3 M sucrose and isotonic solution. Embryos were co-cultured on a granulosa cell monolayer and evaluated after 24 hours for re-expansion and at 24, 48, 72 and 96 hours of co-culture for hatching rates. The in vitro survival rates of embryos cryopreserved by the quick-freezing method and two-step cryoprotectant dilution were 1.94; 11.88 and 6.06%, for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively. At the three step dilution, the in vitro survival rates were 4.67; 9.90 and 10.78% for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively.
Subject(s)
Cattle , Cryopreservation/veterinary , Embryonic Development/physiology , Embryonic Structures/embryologyABSTRACT
O objetivo deste estudo foi avaliar os protocolos de capacitaçäo espermática in vitro com 100 mg/ml de heparina e 5 mM de cálcio ionóforo e correlacionar a capacitaçäo com a fertilidade in vivo. A capacitaçäo espermática foi avaliada pela coloraçäo com iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína e pela coloraçäo tripla com vermelho congo, vermelho neutro e giemsa. Os espermatozóides foram avaliados quanto a viabilidade (vivos ou mortos) e a qualidade do acrossomo (lesados ou íntegros), sendo caracterizados como capacitados (vivos e lesados), näo capacitados (vivos e íntegros) e mortos (lesados ou íntegros). A heparina apresentou 64,54 por cento e 39,16 por cento e o cálcio ionóforo 36,41 por cento e 18,11 por cento de espermatozóides capacitados, respectivamente, pela epifluorescência e coloraçäo tripla. Os touros foram divididos em três grupos de fertilidade, sendo o Grupo A <63 por cento, o Grupo B entre 63 e 68 por cento e o Grupo C >68 por cento. Nos três grupos houve diferença significativa (p<0,01) em relaçäo aos espermatozóides capacitados dos tratamentos com heparina e cálcio ionóforo, tanto na epifluorescência quanto na coloraçäo tripla. Näo houve diferença estatística significativa (p>0,01) para os espermatozóides capacitados, näo capacitados e mortos entre os grupos A, B e C, tanto na epifluorescência quanto na coloraçäo tripla para ambos capacitores (heparina e cálcio ionóforo). Näo houve correlaçäo entre os espermatozóides capacitados in vitro e a taxa de fertilidade a campo. A heparina apresentou melhor taxa de espermatozóides capacitados e a epifluorescência mostrou-se mais eficiente na detecçäo da capacitaçäo espermática (p<0,01)